化石资源过度开发与利用使人类面临全球性气候与粮食问题，因此迫切需要发展可持续化学品供应路线。甲醇作为一种新型绿色能源可由CO2加氢制取 ( “液态阳光” 路线)，其生产和利用有助于实现碳中和目标。此外，甲醇还具有还原力高、易储存运输等卓越优点，是一种潜力巨大的非糖基生物炼制基础原料。甲醇生物转化路线可以实现高选择性生产一些结构复杂的长链含氧化学品，如脂肪酸和脂肪醇，能够与现有化工路线形成良好互补。然而，与传统的糖基发酵碳源相比，甲醇及其代谢产物甲醛的高度生物毒性成为限制其利用的障碍。天然甲基营养型微生物—毕赤酵母，具备甲醇利用途径与甲醇诱导表达系统，是理想的甲醇生物炼制宿主。目前已在毕赤酵母中实现了多种化学品的甲醇生物合成，但是产物得率普遍较低，需要进一步改造。
7月11日，我组在PNAS上发表文章 “Methanol biotransformation toward high-level production of fatty acid derivatives by engineering the industrial yeast Pichia pastoris”，在毕赤酵母中通过优化中心代谢与甲醇利用途径，实现了脂肪酸与脂肪醇的高效甲醇转化生物合成（图1）。
图1. 甲醇生物转化概念图
研究首先通过敲除脂酰辅酶A合成酶基因FAA1和FAA2 阻断毕赤酵母β-氧化过程，使菌株成功积累了脂肪酸，但以甲醇为碳源时，脂肪酸得率只有葡萄糖的48%。脂肪酸的生物合成需要消耗大量的乙酰辅酶A与还原性辅酶（NADPH），为了进一步提高脂肪醇产量，对细胞中心代谢与辅酶供应进行了全局优化。通过构建细胞质柠檬酸裂解途径（ACL）与磷酸转乙酰基途径（XFPK-PTA）增加细胞质中前体乙酰辅酶A的供应。另外，通过过表达异柠檬酸脱氢酶（Idp2）强化了NADPH的再生过程，有效提高了脂肪酸产量。
以甲醇为底物进行脂肪酸合成时，细胞甲醛积累量显著增加，产物合成与甲醛细胞毒性会对毕赤酵母产生双重胁迫压力，导致产物合成效率下降。因此，通过高表达内源磷酸二羟丙酮合酶（Das2）强化了甲醛同化过程，显著降低细胞甲醛积累与ROS水平，提高了细胞活力与脂肪酸产量。最终，工程菌株在1 L生物反应器中以甲醇为唯一碳源实现了23.4 g/L的脂肪酸积累，达到了理论得率的24%（图2）。
图2.毕赤酵母代谢改造以甲醇为底物生产脂肪酸
进一步通过代谢流切换策略，将脂肪酸生产菌株快速改造为脂肪醇生产菌株，以甲醇为唯一碳源进行分批补料发酵时，脂肪醇产量达到2.0 g/L（图3）。研究所构建的细胞工厂为目前甲醇生物转化的最高水平。该工作可作为甲醇生物转化研究的一个典型示范，为毕赤酵母甲醇生物炼制工业应用奠定基础，工作中揭示的甲醇调控规律也将为其他人工甲基营养菌株的构建提供借鉴。进一步结合 “液态阳光” 路线，有望实现碳中和的生产方式，助力国家 “双碳” 目标的实现。
图3. 代谢切换策略实现甲醇生物转化合成脂肪醇
该工作第一作者是我组博士研究生蔡鹏，通讯作者为周雍进研究员。本工作得到国家自然科学基金优青、面上项目，国家重点研发计划及大连化物所科研创新基金资助。（文/图 蔡鹏）
原文连接：https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.2201711119
