近日，我组博士生蔡鹏、博士后段兴鹏（已出站）为共同第一作者在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上发表了题为 “Recombination Machinery Engineering Facilitates Metabolic Engineering of the Industrial Yeast Pichia Pastoris” 的研究论文，在甲醇酵母代表菌株毕赤酵母中构建了基因编辑工具，强化了同源重组从而实现了精确基因编辑，鉴定了染色体基因整合位点并表征了系列不同表达强度的启动子，此外还发展了双因素调控策略调控了脂肪醇生物合成。

近年来，甲醇生物转化越来越受到广泛关注，毕赤酵母由于能进行高密度发酵，被认为是优良的甲醇生物转化宿主细胞。构建毕赤酵母细胞工厂往往需要系统代谢工程优化与多基因编辑。然而，毕赤酵母代谢工程改造面临三个关键挑战：（1）低同源重组效率制约了精确代谢工程；（2）缺乏基因组整合中性位点限制了稳定菌株构建；（3）缺乏足够启动子限制了多基因表达调控。

针对上述三个挑战，本研究首先强化了毕赤酵母同源重组效率，发现了限制毕赤酵母同源重组修复的关键基因RAD52，其高表达能将单基因编辑效率提升至90%；进一步地，通过对单位点多片段重组修复中多重入侵诱导重排（MIR）动态平衡过程的研究，发现敲除MPH1基因可以使多片段重组效率提升13.5倍。在此基础上，本研究鉴定出46个可用于外源基因整合的中性位点，并在真实摇瓶发酵条件下表征了18个常用启动子的表达谱。最后，利用不同中性位点和启动子的表达差异，发展了双因素调控策略，调控了脂肪醇合成效率，使其产量差异能达到30倍（12.6-380.0 mg/L）。

该研究建立的毕赤酵母高效基因编辑系统，理论上可以实现毕赤酵母稳定装载超过100个外源基因，并能实现基因表达的精准调控，为毕赤酵母的合成生物学研究提供便利，也为其它非常规酵母代谢工程改造提供借鉴。（文/图 蔡鹏）

文章链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkab535